概述：

STEMdiff™ 腎臟類器官試劑盒提供了一種簡易的工作流程，可利用 96 孔板或其他標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)板形式，從人 pluripotent 干細(xì)胞（hPSCs）的 2D 單層細(xì)胞誘導(dǎo)分化出腎臟類器官。雖然這種方法兼容高通量成像和分析檢測，但它限制了類器官在懸浮狀態(tài)下的培養(yǎng)能力，例如在多囊腎病（PKD）研究中促進(jìn)囊腫形成，或?qū)㈩惼鞴侔裨诨|(zhì)中以進(jìn)行血管化研究。

本實驗方案通過對原版 STEMdiff™ 腎臟類器官試劑盒工作流程進(jìn)行修改，解決了這些局限性，從而生成 3D 類器官。該過程首先進(jìn)行為期 7 天的 2D 分化，使 hPSCs 達(dá)到腎祖細(xì)胞階段。隨后將細(xì)胞解離、重聚，并利用 AggreWell™ 微孔培養(yǎng)板進(jìn)一步分化 11 天，最終形成大小和數(shù)量均一的腎臟類器官。

使用 AggreWell™ 800 等規(guī)格的培養(yǎng)板可大量生成 3D 腎臟類器官，每個六孔板可產(chǎn)出 1,500 個類器官；或者使用 AggreWell™ HT 生成較小的重復(fù)樣本，每個 96 孔板可產(chǎn)出 32 個類器官。

圖 1. 使用 STEMdiff™ 腎臟類器官試劑盒生成 3D 人類腎臟類器官培養(yǎng)物的工作流程示意圖

此前在 mTeSR™1 培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)的 hPSCs 在第 -3 天被接種到涂覆有 Corning® Matrigel® 的培養(yǎng)板中。24 小時后（第 2 天），在貼壁細(xì)胞上覆蓋一層額外的 Matrigel®，這將在接下來的 48 小時內(nèi)促使形成中空（cavitated）的 PSC 球體。次日（第 1 天），將培養(yǎng)基從 mTeSR™1 更換為 STEMdiff™ 腎臟類器官試劑盒培養(yǎng)基，啟動中空 PSC 球體的分化程序。在接下來的 18 天內(nèi)，細(xì)胞依次定向分化為晚期原條（late primitive streak），隨后使用 AggreWell™ 微孔板進(jìn)行重聚，最終形成 3D 腎臟類器官。

該方案始于將六孔板中的高質(zhì)量 hPSCs 以單細(xì)胞形式接種到新的六孔板中（第 3 天），隨后形成中空 PSC 球體（第 1 天至第 2 天），球體在第 1 天可見。

圖 2. 接種后 24 小時，細(xì)胞開始形成小而分散的集落

腎臟類器官分化方案開始時，第 -2 天 (A, B) 人胚胎干細(xì)胞（hESCs；H9 細(xì)胞系）和 (C, D) 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs；WLS-1C 細(xì)胞系）的形態(tài)。兩種細(xì)胞系均使用 mTeSR™1 培養(yǎng)基以 3 x 10? 個細(xì)胞/孔的密度接種于六孔板中。比例尺 = 200 µm。

圖 3. 第 1 天，Matrigel 中的集落形成了小的空腔球體，準(zhǔn)備進(jìn)入腎臟類器官分化的第 1 階段

第 1 天，成功形成空腔球體后，(A, B) hESCs（H9 細(xì)胞系）和 (C, D) hiPSCs（WLS-1C 細(xì)胞系）在 mTeSR™1 培養(yǎng)基中的形態(tài)。比例尺 = 200 µm。

圖 4. 腎臟類器官分化過程中，誘導(dǎo)晚期原條階段后第 1.5 天 hPSCs 的形態(tài)

第 1.5 天處于第 1 階段分化期間（誘導(dǎo)晚期原條階段）時，(A, B) hESCs（H9 細(xì)胞系）和 (C, D) hiPSCs（WLS-1C 細(xì)胞系）的形態(tài)。細(xì)胞將經(jīng)歷顯著的死亡，導(dǎo)致部分細(xì)胞脫落和集落縮小。比例尺 = 200 µm。

圖 5. 第 7 天 hPSC 來源的單層細(xì)胞形態(tài)，準(zhǔn)備收集并重聚至 AggreWell™ 中

第 7 天準(zhǔn)備收集并重聚前，(A, B) hESCs（H9 細(xì)胞系）和 (C, D) hiPSCs（WLS-1C 細(xì)胞系）的形態(tài)。可以觀察到早期類器官結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。比例尺 = 200 µm。

圖 6. 第 18 天 hPSC 來源的 3D 腎臟類器官形態(tài)呈球形，內(nèi)部具有卷曲的管狀結(jié)構(gòu)

第 18 天時 (A, B) hESC-（H9 細(xì)胞系）和 (C, D) hiPSC-（WLS-1C 細(xì)胞系）來源的 3D 腎臟類器官的明場圖像。類器官從 AggreWell™ HT 微孔板中取出，置于平底 96 孔板中進(jìn)行成像。比例尺 = 200 µm。

圖 7. 第 18 天的 3D 腎臟類器官顯示出足細(xì)胞、近端小管和遠(yuǎn)端小管的存在

第 18 天時 (A) hESC-（H9 細(xì)胞系）和 (B) hiPSC-（WLS-1C 細(xì)胞系）來源的 3D 腎臟類器官的免疫熒光圖像。類器官顯示出足細(xì)胞（紅色）、近端小管（綠色）、遠(yuǎn)端小管（白色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）的標(biāo)記物。比例尺 = 200 µm。

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